Skip to content

Receptor A2 fosfolipazy typu M jako docelowy antygen w idiopatycznej nefropatii błoniastej ad

3 tygodnie ago

607 words

Późniejsza analiza za pomocą spektrometrii mas i potwierdzenie za pomocą odczynników specyficznych dla białka pozwoliły na zidentyfikowanie i scharakteryzowanie dominującego białka wykrytego przez te krążące przeciwciała. Metody
Próbki surowicy i tkanki nerek
Zbieraliśmy i przechowywaliśmy próbki surowicy od pacjentów z nefropatią błoniastą, pacjentów z innymi zaburzeniami kłębuszkowymi lub autoimmunologicznymi oraz z normalnymi kontrolami (zdrowymi ochotnikami). Próbkom przypisano kody, aby były anonimowe. Instytucjonalna komisja rewizyjna Boston University School of Medicine zatwierdziła badanie, a pisemna świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich badanych. Ponadto, próbki surowicy od zmarłych dawców z zachowaną czynnością nerek uzyskano z banku organowego Nowej Anglii, podobnie jak nerki, od zmarłych dawców, które nie nadawały się do przeszczepu. Próbki te były zwolnione z wymogu świadomej zgody, zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję kontrolną wykorzystaniem narządów i tkanek od zmarłych dawców do badań.
Idiopatyczną błoniastą nefropatię rozpoznano za pomocą biopsji nerek u pacjentów, którzy nie mieli cech sugerujących wtórną nefropatię błoniastą, takich jak przeciwciała przeciwjądrowe lub przeciwciała przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w surowicy (Tabela w dodatkowym dodatku, dostępna z pełnym tekstem tego artykułu). .
Glomeruli wyizolowano z nerek, które nie nadawały się do przeszczepienia przy użyciu stopniowanego przesiewania, 11 i białka kłębuszkowe ekstrahowano w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji (Boston BioProducts). Zanieczyszczające IgG usunięto przez inkubację z Immobilizowanym Proteinem G Plus (Fisher Scientific). Do deglikozylacji białek kłębuszkowych stosowano peptyd N-glikozydazę F (New England BioLabs). Glomerularne glikoproteiny częściowo oczyszczono przez absorpcję przez unieruchomioną aglutyninę z kiełków pszenicy (Vector Laboratories) i wymywanie N-acetyloglukozaminą.
Western Blotting
Ludzki ekstrakt kłębuszkowy lub rekombinowany PLA2R eksprymowany przez komórki ludzkie (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku) poddano elektroforezie w warunkach nieredukujących i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe, zgodnie ze standardowymi protokołami. Ludzką surowicę zastosowano jako pierwszorzędowe przeciwciało w rozcieńczeniu 1: 100, o ile nie wskazano inaczej. Poliklonalne przeciwciało świnki morskiej przeciwko receptorowi A2 fosfolipazy typu M (zwane dalej po prostu PLA2R) hodowano przeciwko pełnej długości oczyszczonemu królikowi PLA2R.12 Przeciwciała owcy przeciwko czterem podklasom IgG stosowano zgodnie z zaleceniami producenta (miejsce wiązania) . Wykrywanie przeciwciał było sprzężonymi z peroksydazą przeciwciałami osła przeciwko ludzkim IgG, IgG świnki morskiej (Jackson ImmunoResearch Laboratories) lub owczą IgG (Sigma). Immunoglobuliny eluowano kwasem z resztek rdzeni próbek z biopsji nerki od pacjentów z błoniastą nefropatią, nefropatią błoniastą tocznia lub nefropatią IgA (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku). To wymyte IgG zastosowano do immunoblotu ludzkiego ekstraktu kłębuszkowego lub rekombinowanej PLA2R bezpośrednio.
Analiza spektroskopii masowej i interpretacja danych
Wycinaliśmy obszary zainteresowania z żeli identycznych z tymi stosowanymi w analizie Western blot i przeprowadzano trawienie trypsyną w żelu, jak opisano wcześniej.13 Analizowaliśmy otrzymane peptydy za pomocą zmodyfikowanej wersji metody, która łączy chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią masową14 i wprowadzono pozyskane dane do istniejących baz danych białek ludzkich w celu identyfikacji odpowiednich białek u naszych pacjentów.
Immunoprecypitacja
Reaktywną lub niereaktywną ludzką surowicę inkubowano z ludzkim ekstraktem kłębuszkowym, immunoprecypitowano Immobilizowanym białkiem G Plus, poddawano elektroforezie w obecności czynnika redukującego i przenoszono z przeciwciałami przeciwko PLA2R zrębu świnki morskiej.
Analiza immunohistologiczna
Kriosekacje zdrowych próbek ludzkiej nerki i biopsji nerki pobranych od pacjentów z błoniastą nefropatią i anonimowymi zostały utrwalone w metanolu i acetonie i zablokowane 10% albuminą surowicy bydlęcej
[przypisy: olejek kokosowy do włosów, obróbka strumieniowo ścierna, rezonans magnetyczny ]

Powiązane tematy z artykułem: obróbka strumieniowo ścierna olejek kokosowy do włosów rezonans magnetyczny