Skip to content

Receptor A2 fosfolipazy typu M jako docelowy antygen w idiopatycznej nefropatii błoniastej ad 5

3 tygodnie ago

539 words

Regiony odpowiadające prążkom antygenu 185-kD i 145-kD w analizie Western blot wycięto, poddano trawieniu trypsyną w żelu i analizowano za pomocą spektrometrii mas. Na podstawie założenia, że sekwencje peptydowe odpowiadające domniemanemu antygenowi docelowemu będą zidentyfikowane zarówno w próbkach o 185 kD, jak i 145 kD, wygenerowaliśmy roboczą listę kandydujących białek (patrz zarówno Tabela 2, jak i Ryc. w Dodatku Dodatek). Użyliśmy dostępnych przeciwciał i rekombinowanych białek, aby przetestować potencjalne antygeny i odkryliśmy, że przeciwciała przeciwko PLA2R zidentyfikowały pasmo kłębuszkowe-białko o tej samej wielkości, co rozpoznawane przez surowicę od pacjenta z błoniastą nefropatią (Figura 2A). Przeciwciała anty-PLA2R u pacjentów z nefropatią błoniastą
Ekspresję komórkową rekombinowanego ludzkiego PLA2R poddano immunoblottingowi z surowicą od pacjenta z błoniastą nefropatią. Wykryto wyraźny prążek, który był nieco mniejszy niż odpowiedni prążek z ekstraktów z normalnych kłębuszków ludzkich (Figura 2A). Jednakże, gdy oba rodzaje próbek były deglikozylowane, migrowały one do tej samej pozycji, co sugeruje niewielką różnicę w całkowitej glikozylacji między natywnym białkiem i formą rekombinowaną. Analiza Western-blot tych samych próbek przy użyciu monospecyficznego przeciwciała poliklonalnego przeciw PLA2R ujawniła identyczny wzór (Figura 2A). Specyficzność próbek surowicy od pacjentów z błonową nefropatią dla rekombinowanej PLA2R ustalono, wykazując, że nie mieli reaktywności z ekstraktami komórek transfekowanych nieistotnym plazmidem (Fig. 2A w Dodatku Uzupełniającym). Wszystkie próbki surowicy od pacjentów z błonową nefropatią, które reagowały z glikoproteiną 185 kD z ludzkich kłębuszków również rozpoznawały rekombinowany PLA2R, dodatkowo sugerując, że pasmo 185 kD z ludzkiego kłębuszka jest rzeczywiście PLA2R.
Następnie potwierdziliśmy, że próbki surowicy od pacjentów z błonową nefropatią i przeciwciałem anty-PLA2R identyfikują to samo białko. Jak pokazano na Figurze 2B (i na Fig. 2B w dodatkowym dodatku), immunoprecypitaty ludzkiego ekstraktu kłębuszkowego inkubowane z reaktywnymi próbkami surowicy od pacjentów z błoniastą nefropatią dały białko 185-kD, które zostało wykryte przez przeciwciała anty-PLA2R w analizie Western blot.
Figura 3. Figura 3. Charakteryzacja odpowiedzi przeciwciała na zredukowany i nieukierunkowany receptor fosfolipazy A2 (PLA2R). Panel A pokazuje Western blot, w którym równe ilości ludzkiego ekstraktu kłębuszkowego (HGE) i równe ilości rekombinowanego PLA2R (rPLA2R) poddano elektroforezie w warunkach redukujących i nieredukujących. Western blotting przeprowadzono z użyciem reaktywnej próbki surowicy od pacjenta z błoniastą nefropatią (MN5) lub poliklonalnym przeciwciałem anty-PLA2R i wykryto za pomocą odpowiednich drugorzędowych przeciwciał. Zarówno próbka surowicy od pacjenta z błonową nefropatią, jak i poliklonalne przeciwciało anty-PLA2R reagowały z natywnym i rekombinowanym PLA2R w stanie nieredukowanym, ale zredukowane białka były reaktywne tylko z przeciwciałem anty-PLA2R. Panel B pokazuje specyficzność podklasy IgG względem PLA2R. HGE początkowo osuszono z próbkami surowicy od sześciu pacjentów z błoniastą nefropatią (MN1 do MN6), a następnie owcze przeciwciała swoiste dla każdej ludzkiej podklasy IgG (1 do 4) i wykryto przeciwciałem anty-IgG skoniugowanym z peroksydazą.
[hasła pokrewne: balsamy do włosów, obróbka strumieniowo ścierna, olejek rycynowy ]

Powiązane tematy z artykułem: balsamy do włosów obróbka strumieniowo ścierna olejek rycynowy